3 Cara Melakukan Kaedah Pewarnaan Gram

2024 Pengarang: Jason Gerald | [email protected]. Diubah suai terakhir: 2023-12-16 11:29

Pewarnaan gram adalah teknik yang cepat dan digunakan untuk melihat kehadiran bakteria dalam sampel tisu dan untuk mengklasifikasikan bakteria sebagai Gram-positif atau Gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fizikal dinding sel mereka. Noda gram hampir selalu digunakan sebagai langkah pertama dalam mendiagnosis jangkitan bakteria.

Teknik pewarnaan ini dinamai saintis Denmark Hans Christian Gram (1853 - 1938), yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1882 dan menerbitkannya pada tahun 1884 sebagai teknik untuk membezakan antara dua jenis bakteria dengan gejala klinikal yang serupa: Streptococcus pneumoniae (juga dikenali sebagai Streptococcus pneumoniae). Pneumococci) dan bakteria Klebsiella pneumoniae.

Langkah

Kaedah 1 dari 3: Menyiapkan Slaid Mikroskop

Langkah 1. Bersedia untuk bekerja di makmal

Pakai sarung tangan dan ikat rambut panjang untuk mengelakkan pencemaran bakteria pada sampel yang anda uji. Bersihkan ruang kerja di bawah tudung asap, atau di kawasan pengudaraan yang lain. Periksa pembakar Bunsen dan pastikan mikroskop berfungsi dengan betul sebelum anda memulakannya.

Langkah 2. Sterilkan slaid kaca mikroskop

Sekiranya slaid kaca kotor, basuh dengan air sabun untuk menghilangkan minyak dan kotoran. Bersihkan slaid dengan etanol, pembersih kaca, atau kaedah lain yang digunakan oleh makmal anda.

Langkah 3. Letakkan sampel ke slaid kaca

Anda boleh menggunakan teknik pewarnaan Gram untuk membantu mengenal pasti bakteria dalam sampel perubatan, atau kultur bakteria yang tumbuh di dalam piring petri. Untuk hasil terbaik, gunakan noda Gram pada sebatan tipis sampel. Sebaiknya gunakan sampel yang berumur kurang dari 24 jam, kerana bakteria yang lebih tua mungkin telah merosakkan dinding sel mereka dan mungkin tidak bertindak balas terhadap pewarnaan Gram.

Sekiranya menggunakan sampel tisu, tambahkan 1-2 tetes ke slaid kaca. Sebarkan pada slaid secara merata untuk membentuk lapisan percikan sampel yang nipis, dengan meluncurkannya menggunakan tepi slaid kaca steril yang lain. Biarkan sehingga kering sebelum melakukan langkah seterusnya.
Sekiranya anda mengambil bakteria dari piring petri, sterilkan gelung inokulasi dalam pembakar Bunsen sehingga menyala, kemudian biarkan sejuk. Gunakan gelung untuk meneteskan air steril ke slaid, kemudian sterilkan dan sejukkan lagi sebelum menggunakannya untuk mengumpulkan sampel kecil bakteria. Selepas itu kacau perlahan.
Bakteria yang disiapkan dalam kaldu mesti diaduk lagi menggunakan vortexer, kemudian diambil dengan gelung inokulasi seperti di atas, tanpa menambahkan air.
Sekiranya anda mempunyai sampel swab (biasanya dilakukan dengan pemegang kecil dengan kapas), sentuh dan putar lembut swab ke atas slaid.

Langkah 4. Suhu yang sedikit tinggi dapat menghasilkan smear yang baik

Panas akan menahan bakteria di atas gelangsar, sehingga tidak mudah larut semasa proses pewarnaan. Ketuk slaid dengan cepat dua hingga tiga kali di atas pembakar Bunsen, atau panaskan slaid di atas pemanas slaid elektrik. Jangan terlalu panas, sampel mungkin rosak. Sekiranya anda menggunakan pembakar Bunsen, itu mestilah api kecil tetapi biru dan bukannya api oren yang besar.

Sebagai alternatif, smear juga dapat dibuat dengan metanol, dengan menambahkan 1-2 tetes metanol ke smear kering, mengeringkan sisa metanol pada slaid dengan membiarkannya di udara terbuka. Teknik ini meminimumkan kerosakan sel dan memberikan latar belakang gambar slaid yang bersih

Langkah 5. Letakkan slaid di atas dulang pewarna

Dulang pewarna terbuat dari logam, kaca, atau plat plastik cetek dengan lapisan lembut di bahagian atas. Letakkan slaid di atas jaring ini, sehingga cecair yang anda gunakan dapat disalirkan ke dalam dulang.

Sekiranya anda tidak mempunyai dulang pewarna, anda boleh meletakkan slaid di dulang plastik untuk mencetak ketulan ais

Kaedah 2 dari 3: Proses Pewarnaan Gram

Langkah 1. Tuangkan cecair violet kristal ke atas smear

Gunakan pipet untuk menyemburkan sampel bakteria dengan beberapa tetes pewarna kristal ungu, juga dikenal sebagai gentian violet. Biarkan selama 30-60 saat. Crystal violet (KV) memisahkan dalam larutan berair menjadi ion KV + dan klorida (Cl-). Ion ini menembusi dinding sel dan membran sel kedua bakteria gram positif dan gram negatif. Ion KV + berinteraksi dengan komponen sel bakteria yang bercas negatif, memberikan sel warna ungu.

Banyak makmal menggunakan violet kristal "Hucker", yang mengandungi ammonium oksalat untuk mengelakkan pemendakan

Langkah 2. Bilas Crystal violet dengan lembut

Miringkan slaid dan gunakan botol mesin basuh untuk menyemburkan aliran kecil air suling atau air paip di atas slaid. Air harus mengalir ke permukaan smear, dan tidak boleh disemburkan secara langsung pada smear. Jangan bilas secara berlebihan. Ia dapat menghilangkan pewarnaan pada bakteria positif Gram.

Langkah 3. Siram smear dengan yodium, kemudian bilas

Gunakan penitis untuk membersihkan smear dengan yodium. Biarkan selama sekurang-kurangnya 60 saat, kemudian bilas dengan berhati-hati dengan cara yang sama seperti di atas. Iodin, dalam bentuk ion bermuatan negatif, berinteraksi dengan KV + untuk membentuk kompleks sebatian besar antara Crystal violet dan iodin (kompleks sebatian CV-I) di lapisan dalam dan luar sel. Kompleks sebatian ini akan mengekalkan warna ungu kristal ungu di dalam sel, di lokasi yang berwarna.

Iodin adalah bahan yang menghakis. Elakkan penyedutan, pengambilan atau sentuhan pada kulit

Langkah 4. Tambahkan peluntur warna, kemudian bilas dengan cepat

Campuran 1: 1 aseton dan etanol biasanya digunakan untuk langkah penting ini, yang mesti dijadualkan dengan berhati-hati. Letakkan slaid pada sudut tertentu, kemudian tambahkan pemutih warna sehingga tidak ada lagi ungu yang dapat dilihat di dalam air yang digunakan untuk membilas. Ini biasanya mengambil masa kurang dari 10 saat, atau lebih sedikit masa jika pemutih mengandungi kepekatan aseton yang tinggi. Hentikan langkah ini dengan segera, jika tidak, pewarna juga akan melepaskan violet kristal dari sel gram positif dan negatif, dan proses pewarnaan mesti diulang. Segera bilas peluntur warna yang berlebihan menggunakan teknik sebelumnya.

Aseton tulen (95% +) dapat digunakan sebagai pengganti. Semakin banyak aseton yang anda gunakan, semakin cepat peluntur berfungsi, jadi anda perlu lebih memperhatikan masa.
Sekiranya anda menghadapi masalah untuk melacak waktu untuk langkah ini, tambahkan pemutih warna demi setetes.

Langkah 5. Taburkan pewarna pembalut ke atas smear, kemudian bilas

Pewarna pembilang, biasanya safranin atau fuchsin, digunakan untuk meningkatkan kontras antara bakteria gram-negatif dan gram-positif, dengan mengotorkan bakteria yang berubah warna (tidak berwarna), iaitu bakteria gram-negatif, merah jambu atau merah. Biarkan sekurang-kurangnya 45 saat, kemudian bilas.

Fuchsin secara intensif akan mengotorkan banyak bakteria gram negatif, seperti Haemophilus spp dan Legionella spp. Kaedah ini baik untuk pemula

Langkah 6. Keringkan slaid

Anda boleh mengeringkannya di udara terbuka untuk mengeringkan, atau mengeringkannya dengan menggunakan kertas alkohol yang dijual untuk tujuan ini. Proses pewarnaan Gram selesai.

Kaedah 3 dari 3: Memeriksa Hasil Pewarnaan

Langkah 1. Sediakan mikroskop cahaya

Letakkan slaid di bawah mikroskop. Bakteria berukuran sangat besar, jadi jumlah pembesaran yang diperlukan akan berbeza dari 400x hingga 1000x. Lensa objektif dengan minyak rendaman disyorkan untuk gambar yang lebih tajam. Jatuhkan minyak rendaman ke slaid, mengelakkan pergerakan sambil menetes untuk mengelakkan gelembung terbentuk. Gerakkan pemegang lensa mikroskop sehingga lensa objektif terpasang ke tempatnya dan menyentuh minyak.

Perendaman minyak hanya boleh digunakan pada lensa yang direka khas, bukan pada lensa "kering"

Langkah 2. Cuba kenal pasti bakteria gram positif dan gram negatif

Periksa slaid di bawah mikroskop cahaya. Bakteria gram positif kelihatan berwarna ungu, kerana violet kristal terperangkap di dalam dinding sel tebal. Bakteria gram negatif akan berwarna merah jambu atau merah, kerana violet kristal dibilas melalui dinding sel nipis, di mana pewarna merah jambu masuk.

Sekiranya sampel terlalu tebal, hasilnya mungkin positif palsu. Warnai sampel baru jika menunjukkan semua gram positif bakteria, untuk memastikan hasilnya betul.
Sekiranya anda menggunakan peluntur warna terlalu banyak, hasilnya boleh menjadi negatif palsu. Warnai sampel baru jika menunjukkan semua gram negatif bakteria, untuk memastikan hasilnya betul.

Langkah 3. Bandingkan hasil yang anda lihat dengan gambar rujukan

Sekiranya anda tidak tahu seperti apa bakteria, pelajari koleksi gambar rujukan, biasanya disusun mengikut bentuk dan noda Gram. Anda juga dapat melihat pangkalan data dalam talian di [Pangkalan Data Patogen Mikroba Nasional, Bakteria dalam Foto, dan banyak laman web dalam talian yang lain. Untuk memudahkan pengenalan, berikut adalah contoh bakteria yang biasanya dijumpai atau penting untuk diagnosis, dikelaskan mengikut status dan bentuk Gram mereka.

Langkah 4. Kenal pasti bakteria gram positif berdasarkan bentuknya

Bakteria diklasifikasikan lebih lanjut mengikut bentuknya di bawah mikroskop, biasanya sebagai cocci (sfera) atau batang (silinder). Berikut adalah beberapa contoh bakteria gram positif (berwarna ungu) mengikut bentuknya:

Gram positif cocci biasanya staphylococci (bermaksud kumpulan cocci) atau streptococci (bermaksud cocci rantai).
'Batang positif gram seperti Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, dan Listeria. Bakteria batang Actinomyces spp. biasanya mempunyai cabang atau filamen.

Langkah 5. Kenal pasti bakteria gram negatif

Bakteria gram negatif (berwarna merah jambu) sering dikelaskan kepada tiga kumpulan. Cocci berbentuk bulat, batang panjang dan nipis, sementara batang coccoid berada di antara.

Gram negatif cocci Yang paling biasa ialah Neisseria spp.
Batang negatif gram mis. E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, dan banyak lagi yang lain. Vibrio cholerae dapat dilihat sebagai batang biasa atau batang bengkok.
Bakteria batang "coccoid" (atau "coccobacilli") negatif gram mis. Bordetella, Brucella, Haemophilus dan Pasteurella

Langkah 6. Periksa dengan teliti jika hasilnya bercampur

Sebilangan bakteria sukar diwarnai dengan tepat, kerana kerapuhan atau sifat lilin di dinding sel mereka. Bakteria ini mungkin menunjukkan campuran ungu atau merah jambu dalam sel yang sama, atau antara sel yang berbeza dalam smear yang sama. Sampel bakteria yang berusia lebih dari 24 jam dapat menunjukkan masalah ini, tetapi ada juga beberapa spesies bakteria yang masih sukar diwarnai pada usia sampling apa pun. Bakteria ini memerlukan ujian yang lebih khusus untuk mengenal pasti, seperti pewarnaan cepat asid, pemerhatian dalam kultur bakteria, media kultur TSI, atau ujian genetik.

Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, dan Propionibacterium spp. semuanya adalah bakteria positif gram, tetapi sering tidak bernoda dengan jelas.
Bakteria kecil dan langsing seperti Treponema, Chlamydia, dan Rickettsia spp. sukar dicemari dengan kaedah Gram.

Langkah 7. Buang semua barang habis dan peralatan yang tinggal

Prosedur pelupusan sampah ini berbeza antara makmal dan bergantung pada bahan yang digunakan. Biasanya, cecair di dulang pewarnaan dibuang dalam botol yang dilabelkan sebagai sisa berbahaya. Rendam slaid dalam larutan peluntur 10%, kemudian buang ke dalam bekas tajam.

Petua

Ingat bahawa hasil noda Gram hanya akan baik jika sampelnya baik. Penting untuk memberi tahu pesakit agar mereka dapat memberikan spesimen yang baik (misalnya, perbezaan antara meludah berbanding batuk dalam untuk mendapatkan sampel dahak).
Sebagai peluntur warna, etanol bertindak balas lebih perlahan daripada aseton.
Mematuhi peraturan makmal standard untuk memastikan keselamatan.
Gunakan sapuan pipi untuk berlatih, kerana mengandungi bakteria gram positif dan gram negatif. Sekiranya anda hanya melihat satu jenis bakteria, anda mungkin menggunakan peluntur terlalu sedikit atau terlalu banyak.
Anda boleh menggunakan gesper kayu untuk menahan gelongsor.

Amaran

Aseton dan etanol adalah bahan mudah terbakar. Aseton akan mengeluarkan minyak dari tangan anda, menjadikan kulit anda lebih mudah menyerap bahan kimia lain. Pakai sarung tangan dan gunakan dengan berhati-hati.
Jangan biarkan smear kering sebelum anda membersihkan noda Gram atau noda.